Заразиха подсолнечниковая (Orobanche cumana Wallr.) – паразитическое бесхлорофилльное растение, поражающее корневую систему растения-хозяина, поглощающее из нее воду, питательные вещества и выделяющее токсичные продукты обмена (рис. 1, 2).
Подсолнечник обладает иммунной системой, включающей разные механизмы защиты в ответ на проникновение заразихи.
Различают две основные системы защиты: узнавание рецепторами растения патоген-ассоциированных молекулярных образцов (recognition of pathogen associated molecular patterns – PAMPs или MAMPs) и индуцированный эффектором иммунитет (effector-triggered immunity – ETI).
У подсолнечника на основании базового защитного ответа, инициируемого на ранних стадиях взаимодействия патогенна и растения, через узнавание рецепторами клетки внедряющегося патогена формируется общая, или неспецифическая, устойчивость.
Под неспецифической резистентностью понимают способность организма противостоять воздействию разнообразных по своей природе факторов.
На начальном этапе прорастания семян заразихи, прикрепления и проникновения гаустории в корень известно несколько механизмов, приводящих к возникновению общей устойчивости подсолнечника к паразиту (рис. 3). К ним относятся снижение экссудации стриголактонов корнями хозяина, укрепление клеточной стенки через поперечное сшивание белков или осаждение на ней метаболитов (лигнин, суберин, каллоза), накопление токсичных фенольных соединений в точке заражения.
В то же время новые вирулентные расы заразихи способны избегать узнавания растительными рецепторами и заражать подсолнечник. В ответ на эту угрозу новые устойчивые гибриды подсолнечника способны узнавать инфицирующие их патогены с помощью белков R (белков устойчивости, или резистентности), взаимодействующих непосредственно или опосредованно с эффекторами патогенов, которые являются видо- или штаммоспецифичными. Такое взаимодействие индуцирует сильный специфический защитный ответ растения, который часто связан с клеточной смертью для ограничения размножения и распространения патогена, и формирует специфическую устойчивость подсолнечника к заразихе. Специфическая резистентность характеризуется высокой степенью противодействия организма к воздействию определенных факторов или их близких групп.
Большинство белков R содержит нуклеотидсвязывающий, протеинкиназный сайты, богатые лейцином повторы и обозначается как белки NBS-LRR. Домен белка, содержащий повтор, богатый лекцином, ответственен за связывание белка с белком, то есть отвечает за распознавание патогена.
Протеинкиназный и нуклеотидсвязывающий домены задействованы в фосфорилировании белков и регуляции экспрессии защитных генов. NBS-LRR-белки участвуют в запуске сигнальных каскадов, приводящих к развитию летальной программируемой клеточной смерти (гиперчувствительный ответ, HR) через генерацию активных форм кислорода (ROS).
На этапе, когда произошло проникновение и заражение паразитом корня, действует ряд механизмов, обусловливающих образование специфической устойчивости подсолнечника. К ним относятся образование внутри сосудов-хозяев гелеобразных веществ, блокирующих передачу питательных веществ; формирование токсичных соединений, убивающих заразиху; гибель внешних клеток корня.
Общая и специфическая устойчивость подсолнечника к заразихе может быть качественной (ее еще называют вертикальной) – обычно она контролируется единичными доминантными генами, и количественной (горизонтальной), передающейся несколькими генами.
Качественная стойкость гибридов подсолнечника к цветковому паразиту достаточно хорошо изучена. Она часто рассматривается как устойчивость «ген против гена» и обычно весьма специфична в отношении определенного гибрида или сорта растения и конкретной расы патогена. Этот тип устойчивости подсолнечника к заразихе не является длительным: под селекционным давлением, оказываемым устойчивыми гибридами, происходит отбор мутаций у патогена. В результате появляются новые расы заразихи, которые поражают устойчивые гибриды подсолнечника. Именно качественная устойчивость подсолнечника к заразихе, которая контролируется единичными доминантными генами, на протяжении длительного времени была мишенью для создания гибридов, устойчивых к этому паразиту.
Возникновение качественной устойчивости подсолнечника к заразихе связывают с генами NBS-LRR (R-гены), контролирующими белки R. R-гены кодируют нуклеотидсвязывающие сайты (NBS) и богатые лейцином повторы (LRR). R-белки участвуют в обнаружении различных патогенов, включая заразиху, бактерии, вирусы, грибы, нематоды, насекомые и оомицеты.
Растительные белки NBS-LRR многочисленны и древние по происхождению. Они кодируются одним из крупнейших семейств генов, известных в растениях. Это большое семейство контролируется сотнями разнообразных генов и может быть подразделено на функционально различные субсемейства, содержащие TIR-домен (TNL) и CC-домен (CNL). R-белки объединяются в основные классы белков генов устойчивости следующим образом: TIR-NBS-LRR, CC-NBS-LLRR, NBS-LRR, PK, TM-CC, LRR-TM, LRR-TM-PK.
У Arabidopsis thaliana генов, кодирующих NBS-LRR, примерно около 150, в рисе посевном (Oryza sativa) – более 400 и, вероятно, значительно больше в крупных геномах растений, которые еще не полностью секвенированы. Многие NBS-кодирующие последовательности были амплифицированы из разнообразных видов растений. В настоящее время в публичных базах данных имеется более 1600 NBS-последовательностей. Они встречаются у несосудистых и голосеменных видов, а также покрытосеменных растений.
Эволюция R-генов растений протекала в основном путем дублирования и равной или неравной мейотической рекомбинации. Исследование генов R, помимо его теоретической ценности, представляет собой значительный практический интерес для создания растительных генотипов, устойчивых к вредным организмам.
У подсолнечника известен ряд генов, вызывающих устойчивость к разным расам заразихи. Стойкость к расам растения-паразита обусловливается обычно доминантными генами: Or1 (вызывает стойкость к расе А), Or2 (стойкость к расам А, В), Or3 (стойкость к расам А, В и С), Or4 (стойкость к расам А, В, С и D), Or5 (стойкость к расам А, В, С, D и Е) и так далее.
Среди всех известных генов наиболее детальный молекулярный анализ был проведен для гена Or5. Для этого гена были идентифицированы 5 локусов SCAR и 1 локус RAPD. Наименьшее расстояние между SCAR маркерами и функциональными генами было обнаружено для RTS05 и составило 5,6 см. Расстояние между SSR локусом СRT392 и Or5 составило 6,2 см.
Как правило, гены устойчивости к заразихе у подсолнечника распределены по хромосомам не случайно, а как бы скученно. Причем они имеют одиночное мультиаллельное расположение (один локус с множеством кодоминантных аллелей, контролирующих устойчивость к разным расам патогена).
Обычно возникновение кластеров близлежащих генов характерно для R-генов и обусловлено внутри- и межгенными обменами участков ДНК, имеющих прямые или инвертированные повторяющиеся последовательности, часто приводящие к неравному кроссинговеру. Продукты R-генов отличаются деталями структурны рецепторных участков и могут связываться с разными по химической структуре элиситорами. Таким образом, у хозяина и паразита устанавливаются расоспецифические взаимоотношения, описываемые как система «ген-на-ген». При этом гены устойчивости у подсолнечника обычно являются доминантными, а гены вирулентности у патогена – рецессивными.
Устойчивое состояние (несовместимость) развивается только в том случае, если комплементарные гены хозяина и паразита находятся в доминантном состоянии. Если же один из них или оба гена рецессивные, то растение восприимчиво, а паразит вирулентен (состояние совместимости).
Взаимодействие продуктов этих генов у хозяина и патогена можно объяснить следующим образом: ген устойчивости R-ген контролирует синтез специфического белка-рецептора, а ген авирулентности (Avr-ген) – специфического элиситора. Их взаимодействие приводит к индукции защитных реакций. Если у растения отсутствует рецептор или у паразита элиситор, то защитная реакция не развивается.
Отсутствие рецепции у чувствительных гибридов подсолнечника к заразихе может быть связано с делецией генов хозяина и паразита (рецептора или элиситора нет вообще) либо мутациями этих генов (взаимодействие элиситор-рецептор ослаблено или потеряно). В этой связи у O. cumana и подсолнечника обнаружена очень высокая частота мутирования локусов, ответственных за заражение хозяина и устойчивость к патогену, превышающая частоту других генов. Однако у паразита в связи с морфологическими и биологическими особенностями развития и широкой адаптационной изменчивостью частота мутирования генов паразитизма намного выше, чем у подсолнечника генов устойчивости к патогену.
У заразихи роль элиситоров выполняют пектолитические ферменты, выделяемые гаусториальными клетками, которые растворяют межклеточные пластинки и при продвижении апекса проростка паразита к сосудам не нарушают кортикальные клетки корня подсолнечника.
Химическая структура R-белков была расшифрована лишь в конце прошлого века. Эти белки содержат несколько участков (доменов). Самый крупный участок имеет большое число (несколько десятков) повторяющихся последовательностей аминокислот, среди которых чаще других встречается аминокислота лейцин (повторы, богатые лекцином, – ПБЛ).
Молекулярные исследования показали, что домен ПБЛ в большинстве случаев соединяется не непосредственно с элиситором. Сначала элиситор, будучи фактором неспицифической патогенности, связывается с определенными молекулами в зараженной клетке, блокируя иммунные реакции. ПБЛ домен R-белка узнает такое соединение, то есть он стоит на страже клетки, предотвращая нападение на нее патогена. Протеинкиназный и нуклеотидсвязывающий участки R-белка обеспечивают передачу сигнала, возникшего в результате взаимодействия домена ПБЛ с элиситором.
Исследования в области наследования генов авирулентности у О. cumana подтвердили схему взаимодействия «ген-на-ген» в системе взаимоотношений заразиха – подсолнечник для рас E и F. В результате использования классического генетического анализа было установлено, что характер доминирования и особенности взаимодействия между генами Or1–Or5 сильно меняются и зависят от расы заразихи, источника устойчивости, от реакции восприимчивой родительской линии, используемой в скрещиваниях. Однако в большинстве случаев устойчивость к паразиту имеет моногенный доминантный тип наследования.
В настоящее время в Украине, России и других странах бывшего СССР селекционные программы, ориентированные на создание гибридов подсолнечника, обладающих устойчивостью к O. cumana Wallr., в основном базировались на одном из серии доминантных генов Or1, Or2 до Or7 (устойчивость к G расе).
В 80-е годы прошлого столетия селекционерами были созданы гибриды, устойчивые к Е расе заразихи, с использованием обычно пяти генов Or1-Or5, которые были найдены в старых сортах подсолнечника из бывшего СССР и Румынии. Эти гены обеспечивали полную (вертикальную) устойчивость к А-Е расам, в основном за счет двух механизмов: химического и механического барьеров (реакция сверхчувствительности и лигнификации).
Первый механизм основан на некрозе паразитарных структур на ранней стадии развития. Он был характерен для подсолнечника, устойчивого к комплексу рас В, у которого гаусториальный орган заразихи погибал в кортикальных клетках корня, не достигая сосудов ксилемы вследствие реакции сверхчувствительности.
Реакция сверхчувствительности (HR от англ. hypersensitive response, реже гиперчувствительный ответ) – механизм, используемый растениями, чтобы предотвратить распространение инфекции, вызванной патогенами. HR характеризуется быстрой гибелью клеток в локальной области вокруг инфекции и служит для ограничения роста и распространения возбудителей на другие части растения. Данный механизм является аналогом врожденного иммунитета у животных и, как правило, предшествует более медленному системному (охватывающему все растение) ответу, что в итоге приводит к системной приобретенной устойчивости.
HR запускается после молекулярно-биологического распознавания патогена. Идентификация патогена обычно происходит, когда продукты генов авирулентности, выделяемые возбудителем, связываются или взаимодействуют опосредованно с продуктами генов устойчивости (R) растения (отношения «ген против гена»). R гены являются высокополиморфными, и многие растения образуют несколько различных типов продуктов этих генов, что позволяет им распознавать продукты генов авирулентности различных патогенов.
На первом этапе HR активация R-генов вызывает выходящий ионный поток гидроксиданионов (OH–) и катионов калия (K+) из клеток. Одновременно с этим происходит вход катионов кальция (Ca2+) и протонов (H+) в клетку.
Во время второй фазы в клетках, вовлеченных в HR, происходит окислительный всплеск. При этом массово образуются активные формы кислорода (АФК) (супероксиданионы, перекись водорода, гидроксильные радикалы), а также активные формы азота (оксид азота и другие). Эти вещества влияют на функции клеточной мембраны, в частности, вызывая перекисное окисление липидов, что ведет к их повреждению.
Изменения в ионном составе клетки и распад клеточных компонентов в присутствии АФК приводит к гибели клеток и образованию местных поражений. Кроме того, активные формы кислорода инициируют отложение лигнина и каллозы. Также АФК вызывают сшивание предварительно синтезированных гликопротеинов, обогащенных гидроксипролином. В частности, при участии тирозина в мотиве PPPPY белка P33, локализованного в матриксе клеточной оболочки, происходит сшивание этого белка в трехмерную сеть. Все эти соединения укрепляют стенки клеток, окружающих инфекционный очаг, создавая барьер и препятствуя дальнейшему распространению инфекции.
В некоторых случаях клетки, окружающие очаг поражения, синтезируют разнообразные противомикробные соединения: фенолы, фитоалексины и связанные с патогенезом (PR от англ. pathogen related) белки, -глюканазы и хитиназы. Эти соединения могут нарушать целостность клеточных стенок бактерий либо задерживать созревание, нарушать метаболизм или предотвращать размножение патогена.
Протекание реакции сверхчувствительности и последовательность разрушения клеточных компонентов растений зависят от каждого отдельного взаимодействия растений и патогенов. Тем не менее, в реакции сверхчувствительности можно выделить ряд общих закономерностей. Так, например, HR при любой паре растение-патоген требуют участия цистеиновых протеаз. Индукция гибели клеток и элиминация патогена также требует активного синтеза белка, функционального актинового цитоскелета и участия салициловой кислоты.
Второй механизм устойчивости подсолнечника к заразихе заключается в накапливании лигнина в поврежденных клетках корня хозяина под воздействием пероксидазы, которая выделяется паразитом. Фермент пероксидаза утилизирует пероксид водорода в клетке. Лигнин (от лат. lignum – дерево, древесина) представляет собой сложное полимерное соединение, содержащееся в клетках сосудистых растений и некоторых водорослях. Одеревеневшие клеточные оболочки обладают ультраструктурой, которую можно сравнить со структурой железобетона: микрофибриллы целлюлозы по своим свойствам соответствуют арматуре, а лигнин, обладающий высокой прочностью на сжатие, – бетону.
Относительно недавно ученые компании DuPont Pioneеr обнаружили в диких видах подсолнечника ген вертикальной устойчивости, который обеспечивает устойчивость к расам F и G. С помощью этого гена был создан первый Pioneеr Protectorтм гибрид, устойчивый к расе G. Кроме того, совсем недавно DuPont Pioneеr нашла новую форму горизонтальной устойчивости System ІІ, эффективную против всех рас. В сочетании с вертикальной устойчивостью System ІІ предотвращает развитие новых рас за счет препятствования развитию побегов заразихи после прорастания.
В последнее время компаниями «Сингента», «Лимагрейн», «Евралис Семенс» и другими также были созданы новые гибриды подсолнечника, устойчивые к G расе паразита, что позволило аграриям выращивать культуру в проблемных регионах.
